Título: Quantificação absoluta de genes (método da curva padrão) por Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (qPCR)

A técnica da qPCR combina uma PCR normal com a detecção de fluoróforo, permitindo que o resultado da reação seja obtido em tempo real. Essa técnica permite a quantificação absoluta de um gene a partir da construção de uma curva padrão, usando uma amostra com concentração conhecida do gene.

A saída do equipamento de qPCR refere-se ao Cycle Threshold (Ct), ou seja, o limite de detecção onde o sinal do gene que está sendo duplicado destaca-se da fluorescência emitida pelos componentes da reação. Este valor é utilizado para se determinar a quantidade do gene alvo na reação.

A conversão deste valor para o numero de cópias do gene na reação é realizada a partir de uma curva padrão. A construção da curva padrão passa pela clonagem e extração do DNA de plasmídeos com quantidades conhecidas do gene alvo, as quais são diluídas de forma serial e incluídas na reação de qPCR.

O cálculo do numero de cópias é feito a partir da regressão dos valores de Ct em função do logaritmo da concentraçâo do gene nas diferentes diluições dos padrões e a aplicação dos coeficientes linear e angular obtidos aos valores de Ct das amostras com concentração desconhecida do gene.

Para a realização da conversão, seria necessária a entrada dos seguintes dados:
Para a Curva Padrão
- Concentração de DNA (em ng/µl) extraído dos plasmídeos clonados
- Diluições dessas concentrações utilizadas para a curva padrão
- Volume do extrato utilizado na reação de PCR
- Numero de pares de bases do plasmídeo clonado
- Numero de cópias do gene de interesse em cada plasmídeo clonado
- Valores de Ct das diluições utilizadas para a curva padrão
Para a conversão
- Valores de Ct das amostras

A saída da função seria, para cada amostra, a quantidade de cópias do gene alvo presente na reação de qPCR. Planejo incluir outras possibilidades de saídas, mediante o fornecimento de novas informações. Por exemplo, caso seja fornecida a informação da concentração de DNA das amostras, a saída será o numero de cópias do gene por nanograma de DNA. Caso a informação fornecida seja a quantidade de solo usado para extração de DNA, a saída será o numero de cópias por grama de solo.